ICHY便携式电化学工作站应用10：一种基于智能手机用于测定陈皮中的黄酮类化合物的便携式电化学传感器
DOI: org/10.1016/j.aca.2024.342981
高效及时地测定陈皮中的多甲氧基化黄酮（主要是川陈皮素和橘皮素）和黄烷酮糖苷（主要是橙皮素），这对于陈皮的生产和其功效的评价至关重要。传统的分析方法（包括基于色谱的方法）通常可以提供高灵敏度和选择性，但需要大型的设备和由专业技术人员操作的复杂程序，在实际应用中不方便。
在本研究中，提出了一种基于智能手机的便携式电化学传感平台，用于快速同时检陈皮中的两种多甲氧基化黄酮（川陈皮素和橘皮素）和一种黄烷酮糖苷（橙皮苷）。最初研究了使用新型三维激光诱导石墨烯 （LIG） 电极电催化川陈皮素、橘皮素和橙皮素。与在电极上制备和改性纳米材料的繁琐复杂的过程相比，通过直接激光划片在合适的衬底上原位形成的激光诱导石墨烯 （LIG） 具有易于制备且成本效益高等优点;因此，它非常适合制造电化学传感。基于聚醚醚酮的激光诱导石墨烯 （PEEK-LIG） 电极对川陈皮素、橘皮素和橙皮素表现出优异的电催化活性，并用于制造高度集成的微电化学芯片和开发便携式电化学传感平台。因此，所开发的具有高灵敏度和低检出限的电化学传感平台用于快速测定实际 陈皮样品中的川陈皮素、橘皮素和橙皮素。
由于所制备的 PEEK-LIG 电极对这三种黄酮表现出高电催化效率，因此开发了一种由智能手机组装而成的便携式电化学传感平台、微型电化学工作站和集成的 PEEK-LIG 微芯片。开发的便携式电化学传感平台对 PMF 和橙皮苷均表现出很高的灵敏度和低检出限。更重要的是，对多甲氧基化黄提取物样品进行的测试表明，开发的便携式电化学传感平台表现出高有效性、高可靠性以及出色的重现性。
图 1. PEEK-LIG 电极的表征。
a）在 PEEK 薄膜上生产 LIG 电极阵列的示意图; b-c）PEEK-LIG 的光学照片和表面 SEM 图像，具有低（b）和高（c）放大倍率; 图 b中的插图显示了 PEEK-LIG 电极的横截面SEM图像; d）XPS，e）XRD 和 （f）PEEK-LIG电极的拉曼光谱; g）原始 PEEK 薄膜和 PEEK-LIG 电极的 LSV; h）使用 PEEK-LIG电极和原始PEEK薄膜的发光LED照片;i）PEEK-LIG电极在含 1 mM K 的 0.1 M KCl 的Fe(CN)63 - / 4 – 溶液的CV具有 5 至 100 mV s−1的不同潜在扫描速率。
如图1d所示，原始 PEEK 和 PEEK-LIG 主要由 284 eV 的C 1s和 533 eV的O 1s 组成，在PEEK中含有痕量的 Si 2p（0.44%）（102 eV）和 Na 1s（1.72%）（在PEEK-LIG中为 1072 eV）。然而，激光照射后 PEEK 薄膜的 C 1s 含量从 85.21 % 下降到 77.41 %，而O 1s 含量从 14.35 % 增加到 20.87 %。获得高分辨率 C 1s XPS 谱图，进一步研究PEEK薄膜和 PEEK-LIG 电极的化学官能团。
通过XRD检查激光照射前后PEEK薄膜的结晶度（图 1e）。18.7°、20.7°、22.5° 和 28.7° 处的特征峰分别归因于纯PEEK晶面（110）、（111）、（200）和（211）。正如预期的那样，26.0°处的峰归因于石墨晶面（002），显示层间距约为0.34 nm [27,33]，并且是在PEEK-LIG电极中新发现的。此外，所制备的 PEEK-LIG 电极的拉曼光谱显示出三个突出的峰：1350 cm−1处的 D 带，G 带位于 1590−1 厘米处和 2705 cm−1处的 2D带。所有这些峰都是石墨烯的特征。值得注意的是，由于强烈的荧光背景干扰，在相同条件下（激发波长为 532 nm）无法获得原始PEEK的拉曼光谱。D和G波段的强度比（ID/我G），这与结构缺陷的程度有关，为0.57, 2D和G波段的强度比，这与石墨烯层有关，为 0.33。
此外，为了确定制备的 PEEK-LIG 电极的电导率，获得了激光照射前后 PEEK 薄膜的线性扫描伏安图（图 1g）。PEEK-LIG 电极的电阻估计约为 70 Ω，7 × 109Ω用于具有相同形状的原始 PEEK 电极。如图 1h 所示，PEEK-LIG 电极用作照明发光二极管的导体，进一步直观地证明了其导电性的提高。
因此，所制备的具有三维多孔结构和高导电性的 PEEK-LIG 电极可用于电化学应用。图 1i 显示了 PEEK-LIG 电极在含有 1 mM Fe(CN)63 - / 4 –的 0.1 M KCl 溶液中的典型循环伏安图（CV）作为电化学探针，具有不同的电位扫描速率（5 至 100 mV s−1）.一对定义明确且可逆的氧化还原峰，形式电位为 0.24 V，对 Ag| AgCl即使在 100 mV s−1的高电位扫描速率下也能观察到，表示Fe(CN)63 - / 4 –的有效电子转移在PEEK-LIG电极处。阳极和阴极峰值电流都随电位扫描速率的平方根线性增加，表明有效电子扩散可以控制电化学过程。所有这些结果表明 PEEK-LIG 电极具有很高的电化学活性，可用于制造电化学传感器。
3.2. 使用 PEEK-LIG 电极对 PMF 和橙皮苷进行电化学氧化
为了检查是否使用 PEEK-LIG 电极进行电化学检测 PMF 和橙皮苷，在不存在和存在 PMF 或橙皮苷的情况下，对制备的 PEEK-LIG 电极在含有 10 % （v/v） 甲醇的乙酸盐缓冲液（0.2 M，pH 5.1）中的 CV 进行了检测。如图 2a 所示，与在空白缓冲溶液中使用 PEEK-LIG 电极的 CV 相比，使用 PEEK-LIG 电极添加 100 μM 川陈皮素后，在 1.2 V 至 1.4 V 的电位范围内清晰观察到两个微弱但可检测的阳极峰。在 1.27 V 的电位下仅检测到一个阳极峰 （p1），在 100 μM tangeretin 存在下（图 2b）和 0.6 V 的两个阳极峰 （p3） 和 1.0 V （p4） 在橙皮苷存在下观察到 （图 2c）） 使用 PEEK-LIG 电极。这些阳极峰应由 PEEK-LIG 电极上的类黄酮电氧化产生。
图 2.使用 PEEK-LIG 电极电催化川陈皮素、橘皮素和橙皮素。
a-c）在含有 10 % （v/v） 甲醇的乙酸盐缓冲液（0.2 M，pH 5.1）中，不存在（虚线）和存在（实线）100 μM 川陈皮素 （a）、橘皮素 （b） 和橙皮素 （c） 的 PEEK-LIG 电极的 CV。d-f） PEEK-LIG 电极在 100 μM 川陈皮素 （d）、橘皮素 （e） 和橙皮素 （f） 中的血管 SVV 含有含有 10 % （v/v） 甲醇的乙酸盐缓冲液 （0.2 M），具有不同的 pH 值。SWV 参数：振幅电位 25 mV，频率 5 Hz。虚线表示 PEEK-LIG 电极在含有 10 % （v/v） 甲醇的乙酸盐缓冲液（0.2 M，pH 5.1）中的背景。g-i） 川陈皮素 （g）、橘皮素 （h） 和橙皮苷 （i） 的氧化峰电位对电解质 pH 值的依赖性。
方波伏安法 （SWV） 比 CV 更敏感。为了确认和研究上述三种黄酮的电化学氧化，记录了制备的 PEEK-LIG 电极在含甲醇的乙酸盐缓冲液 （0.2 M） 中 4.1 至 5.9 和 100 μM 川陈皮素、橘子素和橙皮素的 SWV（图 2 d-f）。由于两个 p1 均未观察到明显的峰偏移（在 1.27 V 与 Ag|AgCl） 和 p2（在 1.35 V 与 Ag|AgCl），川陈皮素和橘皮素氧化的电化学过程被认为是 pH 无关的。相比之下，p3 的氧化峰和 p4因为橙皮苷随着 pH 值的增加而向负方向移动，表明橙皮苷氧化的电化学过程中参与了质子转移。与 −54.8 mV pH−1 斜率的线性关系和 −55.1 mV pH−1 值对于 P3和 p4橙皮苷进一步表明，橙皮苷的电化学氧化涉及相同数量的质子和电子。
在这里，我们试图通过考虑黄酮的化学结构和电化学特性来了解使用 PEEK-LIG 电极的类黄酮的电化学反应机理。 图 S4 显示了在不存在和存在 3'，4'-甲氧基黄酮和 4'-甲氧基黄酮的情况下制备的 PEEK-LIG 电极的 SWV。在约 1.31 V 处与 Ag|3'，4'-甲氧基黄酮记录了 AgCl，而 4'-甲氧基黄酮没有观察到明显的峰值。这些结果表明，p1 川陈皮素和橘皮素都是由 A 环处的甲氧基氧化产生的，而 p2 的氧化峰因为川陈皮素是由 B 环处的 3′-甲氧基氧化产生的。这些结果与该报告一致，即伏安图上川陈皮素的两个阳极峰可能是由 A 环上的甲氧基和 B 环上的另一个甲氧基的氧化引起。对于橙皮苷，根据我们之前的研究，p3的氧化峰是由 B 环上的 3′-羟基的电化学氧化生成的，而 p4 可能是由A环上的羟基氧化产生的。羟基的电氧化涉及单电子和单质子过程，这也与在不同电解质 pH 值下通过动力学分析获得的结果一致。
3.3. 用于同时检测川陈皮素、橘皮素和橙皮素的便携式电化学传感平台
尽管 PEEK-LIG 电极对川陈皮素、橘皮素和橙皮苷表现出优异的电催化效率，但传统的电化学系统基于笨重的电化学工作站，在玻璃电解槽中具有独立的参比电极、对电极和工作电极 不便于实际应用。开发和测试了一个便携式电化学平台，该平台由微型电化学工作站、智能手机和基于 PEEK-LIG 的集成电化学芯片组装而成。图 3a 显示了制备的集成电化学芯片，带有 PEEK-LIG 对电极、PEEK-LIG 工作电极和 Ag 参比电极。集成的电化学芯片通过适配器连接到微型电化学工作站，并将智能手机用作操作和显示平台（图 3b）。为了证明所制备的便携式电化学传感平台的有用性，Fe(CN)63 - / 4 -进行了调查。图 3c 显示了 Fe(CN) 63 - / 4的循环伏安图-具有一对明显的氧化还原电化学峰; 此外，它们的峰形与具有常规独立三电极的商用电化学分析仪收集的峰形相似，表明所制备的便携式电化学平台的成功。氧化还原电位的变化归因于采用的不同参比电极。
图 3.用于同时检测川陈皮素、橘皮素和橙皮苷的电化学传感平台。
a)制备的集成电化学芯片阵列的典型照片; b） 基于智能手机的便携式电化学传感平台、微型电化学工作站和集成电化学芯片; c） 1 mM Fe(CN)63 - / 4 - 的 CV在由制备的便携式电化学传感平台（实线）和常规三电极平台（虚线）收集的乙酸盐缓冲液（0.2 M，pH 5.9）中; d-i） 不同浓度川陈皮素 (d）、橘皮素（e）、橙皮素（f）和川陈皮素与橙皮苷混合物（g）、橘皮素与橙皮苷混合物（h）以及川陈皮素、橘皮素和橙皮苷混合物（i）的便携式电化学传感平台 SWV。SWV 参数：振幅电位为 25 mV，频率为 5 Hz。d 到 i 中的插图显示了电流响应与类黄酮浓度之间的关系。
图 3d-i 显示了使用开发的便携式电化学传感平台在不同浓度下川陈皮素、橘皮素、橙皮素及其混合物的 SWV。明显的氧化电流峰值约为 1.07 V （p1） 和 1.16 V （p2） 对于川陈皮素，在约 1.08 V（p1） 和 CA 的0.42 V（p3） 和 0.83 V（p4）中检测到橙皮苷。电流响应随着类黄酮浓度的增加而增加，表明氧化电流是由类黄酮产生的。与商业 Ag|AgCl 电极，如图 2 所示，这可能是由所用参比电极的不同氧化还原电位引起的。值得注意的是，p1和 p3具有比 p 更清晰的形状2和 p4因此更适合于川陈皮素和橙皮苷的检测。此外，选择乙酸盐缓冲液的 pH 值为 5.9，因为 p1和 p3比 pH 值为 5.1 时。图 3d-i 中的插图显示了当前响应与类黄酮浓度之间的关系。因此，在所有情况下，电流响应都随着类黄酮浓度从 5 μM 增加到 100 μM 而线性增加。川陈皮素、橘皮素和橙皮素的斜率为 2.58 mA cm− 2 mM− 1、2.24 mA cm− 2 mM− 1和 0.24 mA cm− 2 mM− 1，当它们单独添加时。斜率为 2.63 mA cm− 2 mM− 1和 0.16 mA cm− 2 mM− 1分别用于川陈皮素和橙皮苷，以及 2.21 mA cm− 2 mM− 1和 0.15 mA cm− 2 mM− 1分别用于橘皮素和橙皮苷，当川陈皮素和橘皮素分别加入橙皮素时。p 的相似斜率和相同峰电位1对于川陈皮素和橘皮素在两种情况下（即添加或不添加橙皮苷）都表明两者都可以估计为 PMF。正如预期的那样，斜率为 2.36 mA cm− 2 mM− 1对于多甲氧基化黄酮（川陈皮素和橘皮素的混合物）和 0.17 mA cm− 2 mM− 1对于橙皮苷，当同时添加所有三种黄酮类化合物（川陈皮素、橘皮素和橙皮苷）时。此外，理论上计算出多甲氧基化黄酮和橙皮苷的检测限（信噪比为 3 时）分别为 0.1 μM 和 1.7 μM。
3.4. 陈皮中多甲氧基化黄酮和橙皮苷的测定
为了证明我们开发的便携式电化学传感平台的实际应用能力，使用网状陈皮果皮的提取物作为实际样品。图 4a 显示了制备的便携式电化学传感平台在不同体积的陈皮提取物下的 SWV。添加提取物后，在约 0.45 V、0.70 V、1.06 V 和 1.15 V 处观察到四个明显的氧化峰。大约橙皮苷的电氧化产生 0.45 V（p3），而峰值在 ca.1.06 V 和 ca.1.15 V 归因于 多甲氧基化黄酮的电氧化 （p1和 p2).大约0.70 V 可能由提取物中的其他化学物质产生。通过图 3i 中的方程计算峰值电流响应以及 PMF 和橙皮苷的最终浓度，并随着添加的陈皮提取物的体积线性增加（图 4b 和 c）。结果，陈皮提取物中多甲氧基化黄酮和橙皮苷的原始浓度分别为 1.26 ± 0.08 mM 和 1.89 ± 0.04 mM;这些值与常规高效液相色谱法检测到的值几乎相同，川陈皮素为 0.67 ± 0.01 mM（即 2.69 ± 0.02 mg g）−1），0.50 ± 0.01 mM（即 1.87 ± 0.01 mg g）−1）和橙皮苷为 1.81 ± 0.02 mM（即 11 ± 1 mg g−1)。这些结果表明，所开发的便携式电化学传感平台具有很高的有效性。
图 4. 测定真实 CRP 提取物样品中的 PMF 和橙皮苷。
a）便携式电化学传感平台的 SWV，将 1 至 5 μL 不同体积的陈皮提取物添加到 100 μL 乙酸盐缓冲液（pH 5.9, 0.2 M）中;b）当前响应与添加的陈皮提取物量之间的关系;c）计算的添加陈皮提取物的浓度和体积之间的关系;d）陈皮提取物中便携式电化学传感平台的 SWV 含有乙酸盐缓冲液（pH 5.9， 0.2 M）并添加了不同浓度的多甲氧基化黄酮（川陈皮素和橘皮素的混合物）和橙皮苷; e）当前反应与多甲氧基化黄酮和橙皮苷的增加浓度之间的关系; f）多甲氧基化黄酮和橙皮苷的检测浓度与添加浓度之间的关系。g）将 1 μL 陈皮提取物加入 100 μL 乙酸盐缓冲液（pH 5.9, 0.2 M）中，将 7 个独立制备的便携式电化学传感系统的 SWV; h-i）电流响应以及 7 个独立制备的便携式电化学传感系统检测到的多甲氧基化黄酮h）和橙皮（i）浓度。SWV 参数：幅度电位 25 mV，频率 5 Hz。
此外，通过标准添加方案研究了所制备的便携式电化学传感平台的可靠性。图 4 d 显示了所制备的便携式电化学传感平台在含有陈皮提取物和不同浓度黄酮的电解质中的典型 SWV。特色氧化峰在 ca.0.45 伏（p3）用于橙皮苷和 ca.1.06 V（p1）和 ca.1.15 V（p2）在添加陈皮提取物和类黄酮后观察到多种多甲氧基化黄酮。p的当前响对于多甲氧基化黄酮和 p3橙皮苷随着橙皮苷浓度的增加而线性增加（图 4e）。斜率为 2.11 mA cm− 2 mM− 1和 0.17mA cm− 2 mM− 1分别用于多甲氧基化黄酮和橙皮苷。这些值接近于在乙酸盐缓冲液中获得的值（图 3 g-i）。根据图 3i 中的回归方程计算 PMF 和橙皮苷的浓度，并与添加的浓度显示出良好的线性关系（图 4 f）。表 1 总结了在含多甲氧基化黄酮提取物的缓冲液中测定多甲氧基化黄酮和橙皮苷的结果;回收率从 90 % 到 107 % 不等，这表明所制备的便携式电化学传感平台具有很高的可靠性。
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